丝袜玉足 基于环介导恒温扩增本事的大肠杆菌<b>O157:H7</b>快速检测试剂盒的评价

大肠杆菌(Escherichia coli) O157:H7是肠埃希氏菌中血清型毒力较强的菌种代表，激勉以泻肚为主的动物源性传染病[1-2]。大肠杆菌O157:H7传播路线宽阔，包括食源性传播、水源性传播以及东说念主畜交游传播等，其中以食源性传播更为普遍[3]。连年来，我国大无数地区均出现大肠杆菌O157:H7感染疫情，一般为患病者进食被该致病菌沾污的食物所致，何况阐扬出昭着的季节性暴发，多辘集在7-9月[4-6]。大肠杆菌O157:H7可感染悉数年岁阶段的东说念主群，非常是儿童和老东说念主发病率较高，何况会激勉多种严重的并发症丝袜玉足，如溶血性尿毒详尽征(HUS)和血栓形成性血小板减少性紫癫(TTP)，具有毒力强、病死率高档特质[7-8]。截止当今，尚未发现存看护大肠杆菌O157:H7感染的疫苗，因此关联该菌感染疫情的甘休多辘集在对食物、水源等的早期检测方面。刻下已成立了多种大肠杆菌O157:H7检测样貌，主要包括选定传统培养基法(病原微生物分离坚忍、形态学坚忍及自动化坚忍样貌)、酶联免疫本事、核酸探针本事、核酸扩增(PCR)本事等[9-10]，但这些样貌阐扬出检测周期长、操作复杂、仪器粗豪、资本高档不及，何况多局限在实验室检测，难以满足鄙人层现场的快速检测需求。

环介导恒温扩增本事(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是由Notomi就是2000年拓荒的一种新式的体外等温扩增特异核酸片断的本事[11-12]。该本事利用两对特殊引物和具有链置换活性的Bst (Bacillus stearothermophilus) DNA团员酶，能在65℃附近恒温条款下使引物班师与模板招引并进行链置换扩增响应，无需复杂仪器，大大省俭了响当令刻，其收尾判读、灵巧度、特异性、检测鸿沟及应用资本等远优于其他分子检测样貌，因此基于该本事的检测产物将更适用于下层单元的快速检测需求。鉴于此，笔据我国现存联系质检行业程序本事文献，本研讨对研制的基于LAMP本事的大肠杆菌O157:H7快速检测试剂盒的性能和检测质料水平进行测试和评价。中式不同分娩批次的试剂盒，对该试剂盒检测大肠杆菌O157:H7的特异性、灵巧度、准确度、重叠性、保质期及运输表现性等进行分析，评价了该试剂盒用于千般不同食物样品的大肠杆菌O157:H7检测的适用性。

1 材料与样貌 1.1 主要材料和试剂

E. coli O157:H7 ATCC 35150、E. coli O157:H7 ATCC 43889、E. coli O157:H7 ATCC 700728、E. coli O157:H7 NTCT 12900、E. coli O157:H7 CMCC(B) 44828、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC 25923、福氏志贺氏菌(Shigella flexneri) CMCC(B) 51572、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) ATCC 9027、粪肠球菌(Enterococcus faecali) ATCC 29212、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii) ATCC 29544、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus) ATCC 17802、单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogene) ATCC 19115、肠炎梵衲氏菌(Salmonella enteritidis) ATCC 13076、产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes) ATCC 13048、乙型溶血性链球菌(Beta-hemolytic streptococcus) ATCC 21059、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) CMCC(B) 63501、E. coli CMCC(B) 44102和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) CMCC(B) 31001均由广东环凯微生物科技有限公司提供。

大肠杆菌O157:H7的LAMP快速检测试剂盒共5批次(鉴识为20150313、20150412、20150511、20150610、20150712)，由本实验室研制，其中枢构建组分包括干粉试剂、复溶液、显色液、裂解液、阳性对照、阴性对照。胰卵白胨大豆琼脂(TSA)、纠正EC肉汤(mEC)、纠正山梨醇麦康凯琼脂培养基(CT-SMAC)、三糖铁琼脂(TSI)、月桂硫酸盐胰卵白胨肉汤-MUG (MUG-LST)、氧化酶试剂、革兰氏染色液、大肠杆菌O157:H7会诊血清、MID生化坚忍试剂盒、半固体琼脂、O157显色琼脂由广东环凯微生物科技有限公司提供。

供试食物样品在世界8个地区(澳门、郑州、乌鲁木都、杭州、南京、石家庄、银川及呼和浩特)进行抽样，包括肉与肉成品、蔬菜以及速冻食物共3类14种代表性食物。

1.2 主要仪器

Shock Mixer-1型高速飞动样品措置器、HKP-9172A型恒温培养箱、WBK-4B水浴恒温箱，广东环凯微生物科技有限公司；3K15型台式高速离心计，德国Sigma公司；DYY-6B型稳压稳流电泳仪，北京市六一仪器厂；Easy Spiral型螺旋接种仪，法国Interscience公司。

1.3 样貌

家庭伦理小说1.3.1 程序菌株DNA样品制备: 取各个菌的崭新培养物，挑取半环菌落置于50 μL裂解液，充分悬浮后99 ℃水浴15 min，12 000 r/min离心10 min后取上清，即为粗提程序菌株DNA样品，-40 ℃保存备用。

1.3.2 本色样品DNA制备: 从各地辘集的样品中每份取25 g置于225 mL mEC肉汤，笔据GB/T4789.36-2008《食物微生物学西席大肠杆菌O157:H7/NM西席》[13]样貌进行前措置及增菌，取增菌液1 mL到1.5 mL无菌离心管中，6 000 r/min离心5 min；弃上清，加入30 μL裂解液，悬浮后99 ℃水浴15 min，12 000 r/min离心10 min，取上清，即得样品粗提DNA，-40 ℃保存备用。

1.3.3 特异性施行: 用5株大肠杆菌O157:H7程序菌株和13株非大肠杆菌O157:H7程序菌株，鉴识制备其DNA样品。每份程序菌株DNA样品选定3个平行测试，操作样貌严格按照试剂盒理会书(_105017001_100001015_100111153991255.html)进行，并与试剂盒所提供的阳性样品对比，响应后的响应液呈荧光绿色为阳性，浅橘红色为阴性。

1.3.4 灵巧度施行: 取大肠杆菌O157:H7程序菌株NTCT12900崭新培养物，挑取一环菌落置于30 mL生理盐水中，飞动摇匀，使菌体均匀悬浮其中，并经生理盐水梯度稀释，稀释倍数鉴识为100、101、102、103、104、105、106、107、108倍，鉴识取以上不同稀释倍数的稀释液50 μL进行螺旋计数。同期取以上不同稀释倍数的稀释液制备DNA样品，具身段式为：鉴识取各个稀释倍数的稀释液50μL置于200 μL预灭菌PCR管中，6 000 r/min离心5 min；弃上清，加入12.5μL试剂盒中提供的裂解液，充分悬浮后经99 ℃水浴15 min，12 000 r/min离心10 min，取上清即得到各个稀释倍数的菌液所对应的DNA粗提样品。用大肠杆菌O157:H7快速检测试剂盒，取以上粗提DNA样品2.5 μL进行测试，其中每份DNA样品选定8个平行测试，与试剂盒提供的阳性样品对比，响应后的响应液呈荧光绿色为阳性，浅橘红色为阴性。另外，经琼脂糖凝胶电泳检测不雅察各个样品响应情况，与计数收尾进行对比，并揣摸最低西席限。菌落计数模式参照GB4789.2-2010《食物微生物学西席菌落总额测定》[14]，该试剂盒最低西席限(CFU)=(本试剂盒检测能检测到的最高稀释倍数的50 μL菌液对应的含菌量)/5。

1.3.5 本色样品检测: 取25 g经措置事后的样品置于225 mL mEC肉汤中，36±1 ℃鉴识培养10 h和18 h。取10 h的培养液经热裂解法赢得DNA样品，用LAMP试剂盒进行测试。取18 h的培养液参照GB/T4789.36-2008样貌进行测试，并对可疑菌落进行坚忍，然后进行统计分析。具体包括：(1) 检出特异性=该试剂盒检测和传统检测样貌均为阴性收尾例数/传统检测样貌为阴性收尾例数×100%；(2) 检出灵巧度=该试剂盒检测和传统检测样貌均为阳性收尾例数/传统检测样貌为阳性收尾例数×100%；(3) 检出准确度=(该试剂盒检测和传统检测样貌均为阳性收尾例数+该试剂盒检测和传统检测样貌均为阴性收尾例数)/被检测悉数样品例数×100%，即暗意该试剂盒检测和传统检测样貌收尾的一致性。

1.3.6 重叠性考据: 参照1.3.4的灵巧度检测收尾，中式大肠杆菌O157:H7程序菌株NTCT12900崭新培养物，挑取一环菌落置于30 mL生理盐水中，飞动摇匀，使菌体均匀悬浮其中，并进一步经生理盐水稀释为101和105倍，经热裂解法赢得相应的DNA样品，鉴识当作高菌量和低菌量方向菌检测样品，另外取无菌生理盐水当作阴性检测样品。用以上5批试制的检测试剂盒，每个批次鉴识取以上高菌量的方向菌检测样品、低菌量的方向菌检测样品及阴性检测样品各2.5 μL进行测试，每份DNA样品选定10个平行测试，其中，批间或批内检测重叠性=批间或批内检测稳妥数/检测总额×100%。

1.3.7 保质期考据: 取5批试制的检测试剂盒置于4 ℃保存，鉴识于保存后1、3、6、9和12个月进行立时检测，均取1.3.6中的低菌量方向菌样品当作检测样品，每个批次的试剂盒取10个平行测试。

1.3.8 表现性考据: 将5批试制的检测试剂盒与冰袋同期置于泡沫盒中，在42 ℃下储存96 h，每24 h对各个批次的检测试剂盒抽检一次，均取1.3.6中的低菌量方向菌样品当作检测样品，每个批次的试剂盒取10个平行测试。试剂盒中心的温度变化见图 1。

1.4 统计学样貌

选定SPSS 19.0软件进行统计学整理和分析，计量贵府以程序差(x±s)暗意，进行t西席，计数贵府则行χ2西席，P＜0.05暗意各异有统计学兴致。

2 收尾与分析 2.1 特异性施行

5株大肠杆菌O157:H7程序菌株样品均浮现昭着荧光绿色，即为检测阳性；而13株非大肠杆菌O157:H7程序菌株样品仍为响应前的浅橘红色，即为检测阴性，而且以上平行测试收尾一致，见表 1和图 2。

2.2 灵巧度施行

稀释倍数在100-106时，对应的检测管均浮现昭着荧光绿色，即为检测阳性；而稀释倍数在107-108时，对应的检测管仍为响应前的浅橘红色，即为检测阴性，见图 3，以上平行测试收尾一致。

经琼脂糖凝胶电泳检测以上不同菌量样品对应的响应产物，如图 4所示，低于稀释倍数106的样品均能浮现出现昭着的梯状条带，收尾标明该试剂盒最低西席限为29 CFU (稀释倍数为106)。

2.3 与传统检测样貌对比研讨

通过对3类14种代表性食物进行检测，收尾浮现，在肉与肉成品、蔬菜和速冻类食物中，该试剂盒联系于传统检测样貌的检出灵巧度均为100%，检出准确度鉴识为89.6%、96.9%和93.8%，总体的检出准确度为92.9% (表 2)，总体上两种样貌的检测收尾具有较高的一致性，具体数据见表 2和表 3。

2.4 重叠性考据

对高菌量的方向菌和阴性菌样品的检测中，该试剂盒批间以及批内检测重叠率均为100%；对低菌量的方向菌样品的检测中，5批试剂盒批内检测重叠率鉴识为90%、90%、100%、100%和90%，批间检测重叠率为94%，见表 4。

2.5 保质期考据

保质期内各个月份的悉数检测响应后均能出现昭着荧光绿色，不同保存时刻段的检测效用均为100%，批间各异不昭着(P＞0.05)，见表 5。

2.6 表现性考据

模拟不同时间段的悉数检测响应后均能出现昭着荧光绿色，不同储存时刻段的检测效用均为100%，批间各异不昭着(P＞0.05)，见表 6。

3 商榷

LAMP本事是一种新式核酸扩增本事，鉴于其恒温、高效等特质，扩增效用大大优于PCR本事。但其响应体系愈加复杂[15]，一般需要将各个因素成立成联系溶液，甚而操作繁琐。加之LAMP响应普遍较PCR更为灵巧，应用过程中看护沾污非常必要，而过于粗俗的操作也易导致联系试剂、检测区间的沾污，甚而假阳性收尾的发生。另外，在LAMP响应体系中，部分试剂需要冷冻储存(如LAMP引物、dNTPs、Bst DNA团员酶)，尤其是其中枢因素Bst DNA团员酶要求在-20 ℃条款下储存，

温渡过高会径直变成酶活性丧失，从而无法达到检测效用。本研讨通过工艺假想，将试剂盒中需要冷冻储存的试剂进行干粉化。保质期考据实验标明，该试剂盒在4 ℃条款下能保存较永劫刻(9个月)，但不忽视保存更永劫刻；短期温度变化(0-42 ℃)表现性考据实验标明，该试剂盒能适合较永劫刻(多达72 h)以及较高温度(42 ℃)环境存储，表现性较好，从而便于远程运输，但为保证检测效用，不忽视始终储存以及过永劫刻运输。总体上，该试剂盒能适合高温远程运输，其使用操作也大大简化，缩短了相应资本，粗浅现场应用。另外，对LAMP响应收尾的判读，之前联系研讨中多有说起，主要包括经琼脂糖凝胶电泳检测不雅察其响应产物梯状条带，以及经肉眼径直不雅察响应产物，如LAMP响应体系中的Mg2+会与响应产物焦磷酸招引形成焦磷酸镁，产生白色混浊物，但随机该浊度未便不雅察，需借助仪器匡助；响应产物双链DNA可招引荧光染料SYBR Green I染色，如有扩增产物时，响应变绿色，反之，仍为橙色。但该染料价钱较高，且操作时需响应后开盖加入，会变成迥殊的气溶胶沾污[16]，可能影响其他响应收尾。本研讨中选定经配比优化的钙黄绿素-Mn2+诱导剂，价钱便宜、热枕不雅察效用昭着，且在响应前加入诱导剂，使收尾判读愈加粗浅、可靠。

传统大肠杆菌O157:H7西席参照GB/ T4789.36-2008[13]，如一般被诳骗的通例培养法是笔据大肠杆菌O157:H7的培养本性、形态学特征、生化特征、血清学施行进行属(种)的坚忍；免疫磁珠拿获本事是通过对大肠杆菌O157:H7进行选定性的增菌，然后利用免疫磁珠进行选定性拿获，后将磁性颗粒涂布到选定性琼脂平板上进行分离。以上过程操作复杂且耗时长(一般3-5 d)，且需要多样试剂及培养基等，大大擢升了检测资本。另外，程序中提到的全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法是基于在自动VIDAS仪器上进行双抗体夹心酶联荧光免疫分析的检测样貌；全自动病原菌检测系统筛选规矩是利用PCR扩增并检测细菌DNA中特异性片断来判断方向菌的存在，以上均需要复杂的试剂及仪器，操作经由以及收尾判读复杂，尤其是难以鄙人层西席单元引申。然而本试剂盒是针对大肠杆菌O157:H7靶基因假想引物，在恒温条款下可达到快速扩增，悉数这个词检测经由约略(前期仅需通过热裂解赢得食物样品DNA，加之试剂响当令刻仅需50 min附近)，何况可径直通过肉眼不雅察得出收尾，加之本实验考据收尾也标明该试剂盒的特异性、灵巧度、准确度、重叠性等筹画均较好。

此外，利用本试剂盒与传统检测样貌对辘集自各个地区的本色食物样品进行同步检测，其收尾具有较高的一致性。粗俗食物中的大肠杆菌O157:H7含量较少[17]，因此在本色检测中有可能因样品辘集不妥、增菌效用欠安等因素导致漏检[18]，而GB/T4789.36-2008[13]中提到通过应用免疫磁珠拿获法对样品中方向进行富集，以擢升其检测效用[19]，本试剂盒异日也有望通过与免疫磁珠拿获法相招引，并进一步优化检测收尾。总之丝袜玉足，本研讨参照商品化食物检测试剂盒评价钱式[20]和食物微生物西席样貌证实本事表率[21]提供的评价决议，证实了该试剂盒大致满足鄙人层现场快速检测的需求，具有遍及的应用远景。